Исследование иммунологических и генетических аспектов различных эндокринных патологий и разработка эффективных методов их диагностики
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), г. Москва
Доля больных с патологией эндокринной системы постоянно увеличивается во всех экономически развитых странах мира. Ведущее место в структуре всех эндокринных заболеваний занимает сахарный диабет (СД), являющийся на сегодняшний день одним из самых опасных вызовов мировому сообществу и важным приоритетом национальных систем здравоохранения. Второе место в структуре эндокринной патологии принадлежит различным заболеваниям щитовидной железы (ЩЖ) (Crafa et al, 2021, Frontiers in Endocrinology). В Российской Федерации в 2019 году также зафиксирован рост заболеваемость болезнями эндокринной системы и системы кровообращения. Так, первичная заболеваемость болезнями эндокринной системы, расстройствами питания и нарушениями иммунной системы возросла за 1990-2019 годы в 4,0 раза (Заболеваемость всего населения России в 2019 году. Статистические материалы. Часть II. М., 2020). Принимая во внимание крайне высокий уровень инвалидизации при эндокринных заболеваниях, отмечается также и рост смертности от данных патологий: в 2020 г. отмечен прирост в 20,2% в сравнении с 2019 г. (Доклад министра здравоохранения РФ Мурашко М.А., 21.07.2020 г. ).
Особую роль в структуре эндокринных заболеваний занимают аутоиммунные эндокринопатии (АЭ). АЭ ассоциированы с риском таких жизнеугрожающих состояний, как диабетическая кома, адреналовый криз и т.п. Более того, нередко у одного пациента имеет место коморбидность аутоиммунных заболеваний эндокринной системы в рамках аутоиммунных полигландулярных синдромов (АПС), что создает сложности в достижении их компенсации. Модель инициации аутоиммунного поражения включает потерю иммунной толерантности к специфической молекуле органа-мишени у лиц с генетической предрасположенностью на фоне воздействия триггерных факторов окружающей среды. При этом интервал между клиническим дебютом отдельных компонентов АПС может составить много лет. Таким образом, у пациентов с АЭ важно спрогнозировать развитие других эндокринопатий с помощью исследования иммунологических маркеров – антител к тканям органов-мишеней, которые могут выявляться за несколько лет до появления ранних специфических симптомов заболевания. В рутинной клинической практике для этого требуется проведение регулярного дорогостоящего скрининга методом иммуноферментного анализа. В подавляющем большинстве случаев подобные исследования не проводятся вовсе или ограничиваются небольшим спектром антител (как правило, к ткани ЩЖ).
Проект направлен на масштабное изучение иммунологических и генетических аспектов заболеваний эндокринного генеза, создание мультиплексных методов анализа характерных биомаркеров, разработку и внедрение в практику учреждений здравоохранения ХМАО-Югры медицинской лабораторной технологии, позволяющей в одном анализе выявлять спектр антител, характеризующих развитие АЭ и других коморбидных патологий.
Одна из задач проекта посвящена разработке метода мультиплексного иммуноанализа для одновременного выявления аутоантител, характеризующих широкий спектр различных АЭ, таких как АПС, аутоиммунные заболевания ЩЖ, сахарный диабет I типа, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, болезнь Аддисона, и коморбидных патологий, таких как опухоли ЩЖ, сочетанные аутоиммунные заболевания (целиакия, B12-дефицитная анемия, аутоиммунный гастрит). В основе метода лежит успешно зарекомендовавшая себя в клинической лабораторной диагностике оригинальная отечественная технология гидрогелевых биочипов, позволяющая в одном анализе образца сыворотки крови выявлять десятки серологических маркеров (Gryadunov et al, 2018, Acta Naturae). Применительно к АЭ, коллективом заявителей был ранее разработан биочип, эффективно выявляющий триплет антицитокиновых аутоантител в образцах сыворотки крови у пациентов с АПС I типа (Savvateeva et al, 2021, International Journal of Molecular Sciences). Развитие данного биочипа и разработка метода на его основе, охватывающего широкий спектр биомаркеров АЭ, позволит впервые установить и описать репертуары аутоантител, характерные для изолированных и сочетанных АЭ, в том числе для локальной популяции пациентов.
Проект также будет включать молекулярно-генетические исследования образцов от пациентов «ядерных семей», с наследственностью АЭ в анамнезе. Идентификация генетических маркеров, обладающих прогностической значимостью при оценке риска развития заболеваний эндокринного генеза моногенной или мультифакторной природы, их соотнесение с серологическими маркерами, позволит описать и уточнить молекулярные механизмы развития аутоиммунных и коморбидных эндокринных патологий.
Ключевым этапом проекта является разработка, установка в региональном учреждении здравоохранения и валидация лабораторной медицинской технологии на основе созданных методов мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевом биочипе.
Важнейшей составляющей проекта станет образовательный компонент, направленный на разработку и внедрение образовательной программы «Молекулярные аспекты развития эндокринных патологий». Программа обеспечит качественно новый уровень знаний и практических навыков для студентов и ординаторов ХМАО-Югры в области диагностики и лечения эндокринных заболеваний.
Заявляемый проект включает фундаментальный, технологический, практический, клинический и образовательный аспекты, направленные на развитие науки, повышение качества образования и внедрение отечественных технологий персонализированной медицины в практику учреждений здравоохранения ХМАО-Югры.
Будет разработан, запатентован и валидирован метод мультиплексного иммуноанализа на основе оригинальной российской технологии гидрогелевых биочипов, обеспечивающий одновременное выявление аутоантител в сыворотке крови, характеризующих развитие различных аутоиммунных эндокринных и коморбидных патологий, включая АПС, аутоиммунные заболевания ЩЖ, сахарный диабет I типа, гипергонадотропный Ожидаемые результаты и их значимость (указываются результаты, их научная и общественная значимость (соответствие предполагаемых результатов мировому уровню исследований, возможность практического использования ожидаемых результатов проекта в экономике и социальной сфере, в том числе для создания новой или усовершенствования производимой продукции (товаров, работ, услуг), создания новых или усовершенствования применяемых технологий)).
Будет разработан, запатентован и валидирован метод мультиплексного иммуноанализа на основе оригинальной российской технологии гидрогелевых биочипов, обеспечивающий одновременное выявление аутоантител в сыворотке крови, характеризующих развитие различных аутоиммунных эндокринных и коморбидных патологий, включая АПС, аутоиммунные заболевания ЩЖ, сахарный диабет I типа, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, болезнь Аддисона, целиакию, B12-дефицитную анемию, аутоиммунный гастрит, витилиго, алопецию. Гидрогелевый биочип, являющийся ключевым компонентом метода, будет включать широкую панель иммобилизованных иммунореагентов – аутоантигенов. В дополнение к опубликованному ранее биочипу (Savvateeva et al, 2021, International Journal of Molecular Science), будут подобраны условия для иммобилизации в гидрогеле новых аутоантигенов, таких как карбоангидраза 2, пендрин, натрий-йодный симпортер и др., а также оптимизирована процедура регистрации иммунных комплексов, формирующихся в элементах биочипа в ходе проведения анализа образцов сыворотки крови.
Будет создана и охарактеризована коллекция образцов сыворотки крови от пациентов с различными аутоиммунными изолированными и сочетанными эндокринными заболеваниями, больных эндокринными патологиями неаутоиммунной природы, в том числе с злокачественными опухолями щитовидной железы, а также здоровых доноров. Объем коллекции – не менее 1000 образцов сыворотки крови. Коллекция будет использована для проведения валидации разработанного метода, а также для получения новых данных об иммунологических и генетических аспектах аутоиммунных и коморбидных эндокринных заболеваний.
Будет разработан и апробирован метод мультиплексной детекции на гидрогелевом биочипе биомаркеров, характеризующих опухолевые заболевания щитовидной железы. Биочип будет включать панель иммобилизованных антигенов, таких как субъединица белка T-комплекса, фумаратгидратаза, кальпонин 3, пируваткиназа, фосфоглицераткиназа 1 и др. Будет проведена реализация процедуры мультиплексного иммуноанализа в едином гидрогелевом биочипе, содержащем иммобилизованные аутоантигены, специфичные к аутоантителам, повышенный уровень которых может характеризовать развитие как аутоиммунных эндокринопатий, так и эндокринологических заболеваний неаутоиммунной природы, в том числе опухолей щитовидной железы.
Будут получены новые данные о репертуарах аутоантител, характеризующих изолированные и сочетанные аутоиммунные и неаутоиммунные эндокринные патологии, определены частоты встречаемости аутоантител. Будут определены наиболее перспективные антигены и их репертуары, характеризующие развитие изолированных и коморбидных неаутоиммунных эндокринных патологий, в т.ч. опухолевых заболеваний щитовидной железы.
Будет разработан метод поиска аутоантител против шарнирной области иммуноглобулинов класса G у пациентов с аутоимунными эндокринопатиями, проведена апробация метода мультиплексного иммуноанализа на биочипе с иммобилизованными полученных F(ab')2-фрагментами молекул IgG с использованием образцов сывороток крови пациентов с аутоиммунными эндокринными патологиями и здоровых доноров (выборка не менее 200 образцов). В случае выявления аутоантител против шарнирной области иммуноглобулинов человека класса G в сыворотке крови пациентов, будет проведено их описание, определен спектр частот и репертуары.
Из создаваемой коллекции биоматериала будут отобраны образцы от пациентов «ядерных семей», с наследственностью в анамнезе, для получения препаратов ДНК с целью их дальнейшего молекулярно-генетического анализа. С использованием методов полногеномного и таргетного секвенирования, в том числе генетического секвенатора (анализатора) для секвенирования по Сенгеру, а также системы анализа микрочипов средней и высокой плотности, предоставленных Фондом, будут идентифицированы генетические маркеры, обладающие прогностической значимостью при оценке риска развития заболеваний эндокринного генеза моногенной (например, мутации в гене аутоиммунного регулятора AIRE) или мультифакторной природы.
Будет разработана, адаптирована с учетом особенностей пациентов ХМАО-Югры, установлена в региональном учреждении здравоохранения эндокринологического профиля и валидирована лабораторная медицинская технология на основе созданных методов мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевом биочипе. Будет разработана соответствующая документация на проведение анализа в условиях диагностических лабораторий медицинских учреждений ХМАО-Югры.
Будет создана и охарактеризована коллекция образцов сыворотки крови от пациентов ХМАО-Югры с различными аутоиммунными изолированными и сочетанными эндокринными аутоиммунными и неаутоиммунными заболеваниями, здоровых доноров (не менее 200 образцов), используемая для валидации разрабатываемой лабораторной медицинской технологии, а также для выявления иммунологических и генетических особенностей аутоиммунных и коморбидных эндокринных заболеваний на территории ХМАО-Югры.
В ходе реализации проекта планируется проведение семинаров (не реже одного раза в квартал) в очном и онлайн-формате с привлечением участников коллектива, сотрудников ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, сотрудников и студентов Медицинского института Сургутского государственного университета (СурГУ), работников учреждений здравохранения ХМАО-Югры, в том числе, эндокринологического профиля. Семинары будет включать обсуждение планов этапов проекта, методологических подходов как к разработке технологий, так и к формированию коллекций образцов от пациентов, а также промежуточных результатов работы. Именно такая форма контроля и взаимодействия исследований будет содействовать успешному выполнению задач проекта. В ходе проекта предполагается не менее двух стажировок в год сотрудников Медицинского института СурГУ и работников учреждений здравохранения ХМАО-Югры в ИМБ РАН и ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, с целью теоретического и практического освоения ключевых аспектов исследований эндокринных патологий.
Еще одним ключевым этапом работы станет разработка и внедрение в СурГУ образовательной программы «Молекулярные аспекты развития эндокринных патологий», выполненной совместно членами научного коллектива, сотрудниками ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России и Медицинского института СурГУ. Чтение курса лекций сотрудниками научного коллектива начнется в 2022 г., внедрение программы запланировано на 2023 г. Программа обеспечит качественно новый уровень знаний и практических навыков для студентов (бакалавров и магистров) и ординаторов ХМАО-Югры в области диагностики и лечения эндокринных заболеваний.
1. Формирование коллекции образцов сывороток крови от пациентов с различными аутоиммунными изолированными и сочетанными эндокринными заболеваниями (такими как АПС, аутоиммунные заболевания ЩЖ, сахарный диабет I типа, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, болезнь Аддисона, целиакия, B12-дефицитная анемия, аутоиммунный гастрит, витилиго, алопеция), больных эндокринными патологиями неаутоиммунной природы, в том числе со злокачественными опухолями щитовидной железы, а также здоровых доноров (часть I, объем коллекции - не менее 350 образцов сыворотки крови).
2. Разработка метода мультиплексного иммуноанализа на основе гидрогелевого биочипа, обеспечивающего одновременное выявление аутоантител в сыворотке крови, характеризующих развитие различных аутоиммунных эндокринных и коморбидных патологий, включая АПС, аутоиммунные заболевания ЩЖ, сахарный диабет I типа, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, болезнь Аддисона, целиакию, B12-дефицитную анемию, аутоиммунный гастрит, витилиго, алопецию. Гидрогелевый биочип, являющийся ключевым компонентом метода, будет включать широкую панель иммобилизованных иммунореагентов - аутоантигенов. Подбор условий для иммобилизации в гидрогеле новых аутоантигенов, таких как карбоангидраза 2, пендрин, натрий-йодный симпортер и др., оптимизация процедуры регистрации иммунных комплексов, формирующихся в элементах биочипа в ходе проведения анализа образцов сыворотки крови. Апробация метода с использованием образцов сывороток крови создаваемой коллекции.
3. Подбор антигенов для иммобилизации на биочипе c целью детекции биомаркеров, характеризующих опухолевые заболевания щитовидной железы. Отработка условий иммобилизации антигенов, таких как субъединица белка T-комплекса, фумаратгидратаза, кальпонин 3, пируваткиназа, фосфоглицераткиназа 1 и др. Апробация биочипа с использованием образцов сывороток крови из создаваемой коллекции.
4. Отбор образцов (например, от пациентов «ядерных семей», с наследственностью в анамнезе) для проведения молекулярно-генетического анализа. Получение препаратов очищенной ДНК и проведение таргетного секвенирования по Сэнгеру гена аутоиммунного регулятора AIRE, других генов-мишеней, ответственных за развитие АЭ, в том числе, с использованием рекомендованного Фондом генетического секвенатора (анализатора) для секвенирования по Сенгеру и фрагментного анализа. Первичная оценка полученных результатов.
5. Проведение совместных семинаров (не реже, чем раз в квартал, очно и в онлайн-формате при участии сотрудников ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России) с сотрудниками Медицинского института СурГУ и региональных учреждений здравоохранения ХМАО-Югры с обсуждением планов совместной работы, методических подходов по формированию локальной коллекции образцов сывороток крови от пациентов ХМАО-Югры с эндокринологическими заболеваниями, промежуточных результатов работы. Командировки в г. Сургут руководителя проекта Д.А. Грядунова, основных исполнителей – Е.Н. Савватеевой, Н.Ф. Нуралиевой, Б.Л. Шаскольского (не менее трех командировок).
6. Формирование коллекции образцов сыворотки крови от пациентов ХМАО-Югры с различными аутоиммунными изолированными и сочетанными эндокринными аутоиммунными и неаутоиммунными заболеваниями, здоровых доноров (часть I, не менее 80 образцов). Создание базы данных по образцам.
Реализация проекта позволит:
1. Разработать новые методы исследований биомаркеров развития заболеваний эндокринного генеза, с получением фундаментальных знаний о механизмах развития эндокринных заболеваний на основе данных о серологических и генетических маркерах. Полученные результаты будут опубликованы совместно с научными организациями и образовательными организациями высшего образования Ханты-Мансийского автономного округа-Югры в ведущих мировых научных изданиях – журналах, входящих в первый квартиль по базам данных «Сеть науки» или «Скопус».
2. Разработать и внедрить в учреждениях практического здравоохранения ХМАО-Югры (в т.ч. эндокринологического профиля) медицинскую лабораторную технологию для одновременного обнаружения широкого спектра антител (аутоантител), что позволит диагностировать изолированные и сочетанные аутоиммунные и коморбидные заболевания эндокринного генеза. Разработанная технология будет основана на оригинальной отечественной платформе гидрогелевых биочипов ИМБ РАН, что обеспечит технологическую независимость в текущей экономической ситуации и непрерывность диагностического процесса. Применение технологии в полной мере отвечает стратегии персонализированной медицины, позволяя выявлять биомаркеры на самых ранних стадиях заболеваний задолго до проявления клинических симптомов, в том числе признаков органного поражения.
3. Разработать и внедрить в СурГУ, в перспективе – в других образовательных учреждениях ХМАО-Югры, мультидисциплинарную образовательную программу «Молекулярные аспекты развития эндокринных патологий», которая обеспечит новый уровень знаний и практических навыков для студентов (бакалавров и магистров) и ординаторов ХМАО-Югры в области диагностики и лечения.
1. Genomic Diversity and Chromosomal Rearrangements in Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis. Борис Шашкольский, Дмитрий Кравцов, Илья Кандинов, Екатерина Дементьева, Дмитрий Грядунов, Генеческое разнообразие и хромосомные перестановки в Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis // Международный журнал молекулярной науки. 2022. № 23 (декабрь).
2. Diagnostic Accuracy of Methods for Detection of Antibodies against Type I Interferons in Patients with Endocrine Disorders Нурана Нуралиева, Марина Юкина, Лейла Созаева, Максим Донников, Людмила Коваленко, Екатерина Трошина, Елизавета Орлова, Дмитрий Грядунов, Елена Савватеева, Иван Дедов. Диагностическая точность методов определения антител интерферонам I типа у больных эндокринной патологией // Журнал персонализированной медицины. 2022. № 12 (Ноябрь).